海爾生物醫療新guan肺炎檢測PCR實(shí)驗室建設場(chǎng)景方案一 成都壹科醫療器械有限公司
自新型guan狀病毒發(fā)現以來(lái)，特別是PCR實(shí)驗室新型guan狀病毒核酸檢測工作任務(wù)艱巨。先介紹一下PCR檢測的流程：
1 試劑制備區
功能：主要是作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應混合液的制備，試劑和用于標本制作的材料應直接運送至該區，不得經(jīng)過(guò)其它區域。試劑原材料需貯存在本區內，并在本區內制備成所需的貯存試劑。所需要的儀器設備：
天平（用于精確稱(chēng)量各類(lèi)試劑）→超凈工作臺（涉及對細菌的操作均需在超凈工作臺下完成）→移液器（準確量取特定體積溶液20-100ul）→純水（超純水18.2ΩM.CM）→藥品冷藏箱（短期保存  ）→試劑低溫冰箱（可選2-8°、-20℃）→混勻儀（移取樣本前需要混勻）（推薦艾本森品牌：MixMax漩渦混勻儀）→消毒車(chē)（空間環(huán)境消毒）→滅菌鍋（實(shí)驗室物品、試劑、培養基消毒滅菌）→PH計（配置試劑是精確測量PH值）  
2 樣本制備區
功能：臨床標本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應管和測定RNA時(shí)DNA的合成。所需要的儀器設備
生物安全柜（為了防止有害懸浮微粒、氣溶膠的擴散）→樣本低溫冰箱（-20℃，-80℃保存樣本及DNA）→高速臺式冷凍離心機（用于收集微生物菌體、細胞碎片以及其他沉淀物，有些樣品由于在常溫下不太穩定，需要低溫環(huán)境）→恒溫金屬浴（用于DNA雜交過(guò)程中水浴控溫）（HtPot40恒溫金屬?。?rarr;移液器（準確量取特定體積溶液）→紫外燈或者消毒車(chē)（空間環(huán)境消毒）→混勻儀（移取樣本前需要混勻）（推薦艾本森品牌：MixMax漩渦混勻儀）→超凈工作臺（涉及對細菌的操作均需在超凈工作臺下完成）→低溫搖床（用于大腸桿菌和酵母菌的振蕩培養）→磁力攪拌器(加速溶解固體內容物 )
3 核酸擴增區
功能：主要是DNA擴增，已制備的DNA模板和合成的DNA和主反應混合液，制備成反應混合液等，也可以在本區域內進(jìn)行。在PCR測定中，通常在擴增后須打開(kāi)反應管。
基因擴增儀   （基因檢測DNA/RNA擴增）→熒光定量PCR儀（核酸定量分析）→核酸提取儀（樣品DNA/RNA提?。?rarr;移液器（準確量取特定體積溶液）→紫外燈或者消毒車(chē)   （空間環(huán)境消毒）→超凈工作臺（涉及對細菌的操作均需在超凈工作臺下完成   ）→純水裝置（用于PCR，DNA測序需要超純水）
4 產(chǎn)物分析區
功能：主要進(jìn)行的操作為擴增片段的測定，如使用全自動(dòng)封閉分析儀器檢測，需要儀器設備：
基因擴增儀  （基因檢測DNA/RNA擴增）→熒光定量PCR儀（核酸定量分析）→核酸提取儀（樣品DNA/RNA提?。?rarr;移液器（準確量取特定體積溶液）→紫外燈或者消毒車(chē) （空間環(huán)境消毒）→超凈工作臺（涉及對細菌的操作均需在超凈工作臺下完成   ）→純水裝置（用于PCR，DNA測序需要超純水 電泳儀（水平電泳用于核酸DNA/RNA檢測，垂直電泳用于蛋白檢測，轉印電泳用于將蛋白轉印到膜上做western檢測）→凝膠成像系統/紫外檢測儀（用于核酸瓊脂電泳和蛋白聚丙酰胺的觀(guān)察和拍照，紫外分析儀用于染色后核酸瓊脂電泳膠觀(guān)察，不能連接電腦）→電爐（電泳瓊脂凝膠加熱融化）

新型guan狀病毒（2019-nCov）核酸檢測流程
北京協(xié)和醫院近期發(fā)布了《新型guan狀病毒核酸檢測》標準操作流程。這為我們建設2019-nCov新型guan狀病毒P3實(shí)驗室建設提供了科學(xué)指導。
（PCR核酸檢測實(shí)驗室布局建設 SICOLAB）
具體檢測流程如下
一、核酸檢測前的生物安全防護（工作人員個(gè)人三級防護的穿戴）
1、穿戴流程：
在基因擴增實(shí)驗室的清潔區（更衣區）或者普通實(shí)驗室的潔凈區，工作人員按順序依次穿戴好一次性帽子、醫用N95、一次性防hu服、一次性鞋套、一次性防水靴套、防護目鏡和雙層乳膠手套，進(jìn)入樣本處理工作區域或實(shí)驗室。
2、要點(diǎn)提示：
2.1、具備標準基因擴增布局條件的實(shí)驗室，應在清潔更衣區做好個(gè)人三級防護，條件有限的實(shí)驗室亦可選擇在一潔凈的實(shí)驗室中按流程穿戴好個(gè)人三級防護。
2.2、需佩戴醫用N95，若無(wú)醫用N95，可以考慮用普通N95/KN95外加一次性外科的組合方式，但不要佩戴有呼吸閥的N95。
2.3、佩戴N95時(shí)需檢查密閉性，通過(guò)雙手按壓、深呼吸、左右轉頭等動(dòng)作嚴格檢查是否佩戴正確。
2.4、一次性防hu服已具備新型guan狀病毒核酸檢測的防護需求，有條件時(shí)可以考慮加穿一次性反穿隔離衣，穿衣時(shí)需由他人協(xié)助。
2.5、穿戴整齊的工作人員，應按要求盡快進(jìn)入樣本處理的實(shí)驗區域開(kāi)展工作，嚴禁穿戴三級防護后再進(jìn)入普通實(shí)驗區域或辦公區域。

二、樣本的滅活處理
1、操作流程：
兩名完成三級防護的工作人員，進(jìn)入樣本處理區或樣本處理實(shí)驗室，將接收到的樣本二級包裝在安全柜內打開(kāi)，檢查樣本主容器是否為嚴格密閉；對密封袋表面進(jìn)行消毒后，對送檢樣本進(jìn)行56℃下30分鐘的滅活，滅活后的樣本管需在生物安全柜內打開(kāi)內層的容器，將拭子保存液混勻后進(jìn)行分裝和用于核酸提取。
2、要點(diǎn)提示：
2.1、涉及高致病性病原微生物的實(shí)驗室活動(dòng)，需由兩名工作人員完成，其中一人負責主要實(shí)驗操作，一人提供必要的協(xié)助。主操作者應避免反復多次進(jìn)出安全柜。
2.2、滅活形式：可以采用水浴或空氣加熱形式完成滅活，采用空氣加熱時(shí)可適當延長(cháng)滅活時(shí)間。有條件時(shí)可以采用小型化設備在安全柜內操作，減少樣本進(jìn)出安全柜的次數。滅活前的樣本嚴禁在生物安全柜外打開(kāi)和操作。
2.3、應特別檢查采樣管是否擰緊、有無(wú)樣本溢漏等情況。
2.4、樣本管每次進(jìn)出安全柜均需對外表面進(jìn)行消毒。
2.5、應就近配備適量的消毒處理物品，以防止實(shí)驗操作過(guò)程中可能發(fā)生的意外溢灑事故，有條件時(shí)建議在安全柜內配備一次性吸水臺布。
三、樣本的核酸提取
1、手工核酸提取操作流程（以凱杰的52906柱提法核酸提取試劑盒為例）
1.1、裂解液配制：在基因擴增實(shí)驗室的試劑配制區或單獨的普通試劑配制實(shí)驗室中，準備核酸提取所需的洗液1（AW1）、洗液2（AW2）和carrier RNA。按照要求，分別向洗液1和洗液2中加入分子生物學(xué)級別的130ml和160ml的無(wú)水乙醇并及時(shí)做好標記；取310μl洗脫液（AVE）溶解310μg/支的Carrier RNA。配置好后，通過(guò)傳遞窗進(jìn)入核酸提取區或由工作人員送入核酸提取實(shí)驗室。
1.2、樣本裂解：取560μl AVL裂解液到1、5ml無(wú)菌EP管中，加入5、6μl配制好的Carrier RNA，再加入已經(jīng)滅活的140μl樣本（例如咽拭子、血漿等），混勻振蕩15秒，室溫靜置10分鐘，充分裂解樣本中的核酸。將EP管瞬時(shí)離心后加入560μl無(wú)水乙醇，充分混勻15秒，再次瞬時(shí)離心后備用。吸取630μl裂解產(chǎn)物，小心加入至離心柱中，8000rpm（或6000g）離心1分鐘，轉移離心柱至新收集管，將剩余630μl裂解產(chǎn)物加到離心柱中，重復上一離心操作（若樣本體積大于140μl，則在此步驟重復將630μl裂解產(chǎn)物過(guò)濾收集在一個(gè)離心柱上）。
1.3、核酸的洗滌：取500μl洗液1（AW1）至離心柱中，8000rpm（或6000g）離心1分鐘；換新收集管后，取500μl洗液2（AW2）至離心柱中，8000rpm（或6000g）離心1分鐘；換新收集管后，用14000rpm（或20000g）離心3分鐘，去除洗液2（AW2）；換新收集管后，繼續用離心機大轉速（20000g）離心1分鐘，充分甩離殘留的洗液2（AW2）。
1.4、核酸的洗脫和回收：取一1、5ml無(wú)菌EP管，將離心柱放入其中，加入洗脫液（AVE）40~60μl，室溫靜置1分鐘后，用8000rpm離心1分鐘回收核酸，以備PCR檢測使用。
1.5、要點(diǎn)提示：
（1）、新鮮裂解液的配制應盡可能在專(zhuān)門(mén)的潔凈區域或單獨的實(shí)驗室進(jìn)行。
（2）、要用分子生物學(xué)級別的無(wú)水乙醇試劑進(jìn)行配制。
（3）、向離心柱中加入裂解產(chǎn)物、洗液時(shí)操作要非常小心，盡量將洗頭下探到離心柱內部后靠管壁加樣，切忌出現溢灑后污染到離心柱的密封圈，這可能會(huì )導致乙醇殘留，抑制后續PCR反應。
（4）、從離心機中取出離心柱時(shí)應小心操作，避免離心柱下緣被收集管中的濾過(guò)殘液污染。
（5）、加入洗液2（AW2）后的第二次空管全速離心非常關(guān)鍵，能幫助充分甩離離心柱濾膜中殘留的洗液2殘液，確保洗脫核酸的純度。
（6）、洗脫液加樣時(shí)需小心操作，確保洗脫液盡可能覆蓋全部離心柱濾膜，充分洗脫核酸，提高核酸提取的產(chǎn)量。
（7）、手工核酸提取可優(yōu)選使用檢測試劑盒說(shuō)明書(shū)推薦的配套手工提取試劑，也可選用通用手工提取試劑。
（8）、樣本處理過(guò)程中，工作人員覺(jué)得有必要時(shí)，應隨時(shí)更換新的外層乳膠手套。
2、采用核酸提取儀提取核酸的操作流程
根據核酸提取儀和試劑的說(shuō)明書(shū)準備好提取試劑，取200μl樣本上機提取核酸，并按照要求回收提取好的核酸備用。
要點(diǎn)提示：
1、不同的提取儀器和試劑的提取效率可能存在差異，請一定嚴格按照提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行核酸提取操作。
2、有條件時(shí)可以考慮配備小型化的核酸提取儀在安全柜內使用，以進(jìn)一步加強生物安全防護；若使用在安全柜外的核酸提取儀，則一定要做好生物安全防護及樣本的防污染保護。
四、PCR體系的配制和模板加樣
1、操作流程：
在基因擴增實(shí)驗室的試劑配制區或單獨的實(shí)驗室，配制PCR體系。根據試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求，將試劑盒的不同組分（一般包括反應液、酶、引物等）按照各自必須的體積量進(jìn)行配制混合，充分混勻并離心后，通過(guò)傳遞窗傳遞到核酸提取和加樣區，或由專(zhuān)人從試劑配制實(shí)驗室送至核酸提取和加樣實(shí)驗室。在加樣生物安全柜內，根據檢測樣本例數分裝體系到每個(gè)反應管中，逐一將樣本核酸加入到對應的反應管中，并加蓋密閉好PCR反應管；每批次檢測需要做一個(gè)陽(yáng)性對照和3個(gè)陰性對照。
2、要點(diǎn)提示：
（1）、試劑配制必須嚴格在試劑配制區或單獨、潔凈的實(shí)驗室和安全柜內進(jìn)行，以確保試劑不會(huì )有被污染的可能。
（2）、試劑配制時(shí)要根據檢測樣本數量進(jìn)行合理配制，每批次檢測均需要包括3個(gè)陰性對照和1個(gè)陽(yáng)性對照的試劑，同時(shí)還需要考慮試劑分配過(guò)程中的正常損耗等消耗。
（3）、加樣可以和樣本處理/核酸提取在同一分區或同一間實(shí)驗室進(jìn)行，但如有條件hao在單獨的加樣區或至少使用安全柜進(jìn)行加樣。
（4）、體系分裝建議每次更換新的吸頭，避免反復使用帶來(lái)體積誤差和交叉污染。
（5）、應配置體系加樣登記表，確保加樣過(guò)程準確無(wú)誤。
（6）、PCR密閉管蓋應特別謹慎，建議更換新的手套，防止手套等接觸管蓋內部帶入污染的風(fēng)險。

五、上機檢測及結果分析
1、操作流程：
在擴增區或擴增實(shí)驗室，由專(zhuān)人取出配制好的PCR檢測管，混勻、離心后，小心上機檢測，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)設置擴增參數并分析判讀結果。進(jìn)行結果分析時(shí)，應認真閱讀試劑盒說(shuō)明書(shū)，在了解該試劑盒的靈敏度、檢測方法和局限性等技術(shù)特點(diǎn)的基礎上，結合該批次陰性質(zhì)控的結果，綜合判讀樣本的檢測結果。檢測結束后，為防止可能的擴增污染，擴增結束后的PCR管?chē)澜_(kāi)蓋或帶離擴增實(shí)驗室，應盡快通過(guò)可密封塑料袋等容器盛裝密閉后，放入醫療垃圾桶中做進(jìn)一步處理。
2、要點(diǎn)提示：
（1）、因基因擴增區存在污染的風(fēng)險，應設專(zhuān)門(mén)的擴增區域或在單獨的實(shí)驗室進(jìn)行擴增，必須和核酸提取、試劑配制區域有嚴格的物理分割。
（2）、不同操作區域的工作服不要混穿，特別是基因擴增區的工作服，建議僅在擴增區域或擴增實(shí)驗室內使用。
（3）、熟悉檢測用PCR儀器的基本性能和特點(diǎn)，能客觀(guān)分析判斷檢測結果。
六、檢測后的消毒處理
1、操作流程：
（1）、生物安全柜內：在完成樣本核酸提取后，應在安全柜內用75%消毒酒精對外層手套進(jìn)行消毒處理，并將外層手套取下后棄至安全柜內的垃圾桶中。小心收納并丟棄使用過(guò)的一次性吸水臺布，用0、5%~1%的有效氯消毒劑或75%酒精擦拭安全柜臺面、移液器等安全柜內全部?jì)x器的表面。將安全柜內產(chǎn)生的新型guan狀病毒相關(guān)醫療垃圾經(jīng)3層包裝后，轉移至實(shí)驗室的醫療垃圾桶中。開(kāi)啟紫外燈照射生物安全柜，時(shí)間應大于30分鐘。
（2）、樣本核酸提取工作人員實(shí)驗室內：他人協(xié)助用0、5%~1%的有效氯消毒劑或75%酒精均勻噴灑內層手套、袖口、手臂及隔離衣后，將外層反穿隔離衣脫下至新型guan狀病毒醫療垃圾桶中送高壓處理。
（3）、樣本處理實(shí)驗室內：用0、5%~1%的有效氯消毒劑或75%酒精消毒實(shí)驗室臺面和地面；開(kāi)紫外燈進(jìn)行大于30分鐘的空間消毒。
（4）、工作人員摘脫三級防護：在緩沖區戴新的外層手套，摘護目鏡置于75%酒精浸泡消毒，從頭開(kāi)始，自上而下、由內而外緩慢翻轉脫下一次性防hu服，直到將一次性防水靴套全部脫下，將防hu服置于新型guan狀病毒醫療垃圾桶中送高壓處理。摘kouzhao、帽子、內層鞋套和內層手套后同樣置于新型guan狀病毒醫療垃圾桶中送高壓處理。
（5）、新型guan狀病毒相關(guān)醫療垃圾：所有新型guan狀病毒相關(guān)醫療垃圾均需經(jīng)濕熱高壓滅菌后再作為普通醫療垃圾處理，且垃圾袋上應標注新型guan狀病毒醫療垃圾的相關(guān)信息。高壓處理前后的垃圾要嚴格區分，在高壓滅菌區域對新型guan狀病毒醫療垃圾進(jìn)行濕熱高壓滅菌處理，高壓參數為121℃、30分鐘。高壓要做物理、生物指示，以確保高壓滅菌的效果。
2、要點(diǎn)提示：
（1）、生物安全柜內是風(fēng)險gao區域，操作者的外層手套經(jīng)消毒后必須脫在安全柜內。
（2）、靴套或鞋套的主要作用是對操作者的腳和腿部進(jìn)行防護，要求必須防水，以確保在實(shí)驗室內發(fā)生意外遺灑時(shí)可隔離污染。
（3）、核酸提取儀內部、生物安全柜內部和實(shí)驗室空間均應進(jìn)行紫外線(xiàn)消毒，但紫外線(xiàn)對空氣的消毒效果好，對物體表面的消毒效果隨距離變遠而減弱，故在紫外線(xiàn)消毒前，仍需對各種儀器表面、臺面、地面用消毒劑進(jìn)行擦拭消毒。
（4）、工作人員在摘脫個(gè)人三級防護后，仍應參照實(shí)驗室原有實(shí)驗后操作流程進(jìn)行嚴格認真的常規消毒處理，特別是實(shí)驗后的手衛生環(huán)節。
以上為SICOLAB整理，實(shí)驗室整體設計建設工程、生物樣本建設工程、GMP環(huán)境建設工程、環(huán)保工程。